Ještě pár vzpomínek na E. coli a stolici vůbec

Escherichia coli se běžně nachází v tom, co vykultivujeme z fyziologické a většinou i chorobné stolice nebo výtěrů z konečníku. Dnes to již není takový problém, ale za mých mladých let jsme si tampony na špejli připravovali (motali) sami. Je nutno tomu věnovat určitou péči, protože není nic trapnějšího, než když vytáhnete pacientovi z konečníku holou špejli, protože ta vata na ní nedržela. Finta, nikde nepopsaná, byla například v tom, že se dlouhé špejle lámaly na půl a vata se motala na konce, vzniklé zlomením, kde bylo dřevo roztřepené a vata se na něj lépe chytila.
Dnes se tampony na špejli vyrábějí strojově a dodávají po stovce zatavené sterilní. Což znamená, pokud nemáme nějakou hektickou spotřebu, že jich část stejně balíme do alobalu nebo dáváme do zkumevek a sterilizujeme sami.
ještě dříve se užívala k odběru stolice tzv. rektální rourka. Byla to skleněná trubice, silná asi jako tužka nebo propisovačka, na jednom konci zatavená a v blízkosti toho konce byl z boku otvor, otavený a vmáčknutý dovnitř. Tímto se dalo odebrat i větší množství stolice než na vatu, takže se to dalo použít i na parazity (kdy je třeba stolice víc, než omatlaná vata). Mělo to ovšem své "mouchy". Sklo praská, a tak vím o případu, kdy byl pacient transportován vkleče s vystrčeným zadkem na vozíku z mikrobiologie na chirurgii, kde mu pomocí svých nástrojů a grifů vytáhli z konečníku ulomený konec rektální rourky.
Další možností byla defekace do vhodné nádoby a následné odebrání sterilní lžičkou kousku co do velikosti někde mezi lískovým a vlašským ořechem. Můj bývalý šéf, který byl v rámci zdravotnické pomoci rozvojovým zemím v Africe, vzpomínal na to, jak tam řešili nedostatek odběrového skla tím, že příslušný kousek stolice dali na list (ze stromu či keře) a do něj zapíchli rožek cedulky se jménem (a dalšími údaji) pacienta. Vše pak skládali na velký stůl, který měl před bungalovem, v němž byla mikrobiologická laboratoř.
"Jda do práce, mohl jsem již z dálky čichem odhadovat, kolik budu mít ten den práce", vzpomínal na tuto techniku odběru a transportu vzorků.
Na parazity se odebírají takto velké vzorky v rámci několika dnů. Pacient si to může dělat i sám. Je ovšem nutné ho řádně poučit. Když jsme stážovali na mikrobiologii, tak tamní starší pracovníci po létech s dojetím vzpomínali na pána, který takto poučen nebyl (nebo poučení přeslechl) a chodil poctivě celý týden na stolici do pětilitrové láhve od okurek a ještě ji uchovával (v létě) mezi oknem. Příchod s tímto "vzorkem" stolice na oddělení patrně patřil pro jeho pracovníky k zážitkům, na jaké se opravdu nezapomíná.
Pokud by někoho zajímalo, jak se vyšetřuje stolice na parazity, tak základní vyšetření je takové, že se stolice ve zkumavce rozpatle s nasyceným roztokem bílé skalice (krystalický síran zinečnatý) a následně se tímto roztokem zkumavka doplní až na zarovnání s okrajem. Zakryje se kracím sklíčkem na mikroskopování a čeká se několik hodin až vajíčka vyplavou a přilepí se svým nesmáčivým povrchem na sklíčko. To se pak přenese na podložní sklíčko (těmi vajíčky a dalším sajrajtem ze stolice dolů) a mikroskopuje. Vajíčka jednotlivých druhů či skupin druhů) parazitů mají charakteristický tvar a velikost.
Dnes se ovšem, zejména v rozvojových zemích, dají pacientovi napřed širokospektrá anthelmintika ("protičervové" prostředky). Následuje zpravidla "porod" tak kilového klubka červů různých druhů, a teprve pak se vyšetřuje, zda v něm nějací více rezistentní červíci nezbyli.

Sama E. coli má charakteristický pach, spíše po kvašení než hnilobný. Zejména na půdách, které mají jako identifikační činidlo laktózu. Až staré kultury (48 hodin a déle) začnou páchnout po bakteriálních desaminacích a dalších produktech degradace peptidů (takže cítíme čpavek, indol, skatol atd., ale i mastné kyseliny s krátkými řetězci, jako třeba máselná). Ten pach je docela důležitý a staří zkušení mikrobiologové misky skoro vždy očichávali. Není to mimo realitu, dnes se na některé bakterie vymýšlejí "umělé nosy", které by je právě pomáhaly identifikovat pomocí těkavých látek, které kultura produkuje.
Dlouhá léta se používal jako hlavní půda na identifikaci střevních bakterií (ale i jejich záchytu např. v hnisu z ran nebo z moči) Endův agar. Ten je zajímavý dvěma aspekty:

• jeho činidlo (na principu schiffova činidla) je citlivé na světlo (modré a UV)
• barva kolonií nevzniká na základě tvorby kyseliny z laktózy (jak je to u jiných diagnostických agarů s laktózou), ale aldehydu; z toho důvodu lze najít i bakterie, které jsou pozitivní na Endově půdě, ale na dalších agarech s laktózou se jeví jako laktózu nezkvašující (zvládnou udělat z laktózy aldehyd, který zachytí schiffovo činidlo, ale už ne kyselinu, která změní pH)

Dnes je tento agar odsouván mimo hlavní použití pro podezření na karcinogenitu fuchsinu, který je součástí schiffova činidla.
Normálně se misky s Endovým agarem po vylití hned zakrývají, případně se používají misty s barevnými víčky (v dobách skleněných Petriho misek plechová víčka). Protože jsem na vojně měl u laboratoře temnou komoru, vyléval jsem Endovy půdy tam, při červeném světle, a měl jsem je světlé skoro jak živný agar (tj. jen nažloutlé). Když jsem chodil misky konzultovat, vzbuzovaly u pracovníků civilní mikrobiologie dost podiv a závist.
Buňky E. coli mohou být pohyblivé i nepohyblivé (tento test se dělá na řídkých půdách s jen asi 0,15 - 0,2 procenty agaru, kdy nepohyblivé bakterie zůstanou v místě vpichu, pohyblivé se v tak řídké půdě "rozlezou" a vyvolají zakalení půdy okolo něj).
U enterobakterií se běžně testuje (jako rozlišovací test jednotlivých skupin či druhů) zkvašování cukrů a to, jestli při něm vzniká plyn (běžně existují tabulky na tvorbu plynu z glukózy a manitolu). Produkce plynu se normálně zjišťuje pomocí plynovek, což jsou malé tenké zkumavky, které se dávají do zkumavky s bujonem (tedy tekutou živnou půdou), příslušným cukrem a indikátorem pH dnem vzhůru. Potom se v nich buď zachytí kulturou vytvářený plyn, nebo kultura plyn z daného cukru netvoří a plynovka zůstane prázdná; zkvašení se pozná podle změny pH bujonu na kyselé ze změny barvy indikátoru.
Protože jsem povaha jednak koumavá a jednak líná, vytvořil jsem si systém, který se obešel bez těch titěrných plynovek, které se špatně myjí. Do zkumavky jsem nalil nikoli bujon, ale právě půdu "sulcovitou", s množstvím agaru jako v půdě na test pohyblivosti, a tu jsem následně překryl normální agarovou půdou. Muselo se to očkovat nikoli kličkou, ale holým drátem. Když se tvořil plyn, tak bylo vidět bubliny pod tou tužší půdou, případně bylo plynu tolik, že ji vytlačil jako "špunt" až k ústí zkumavky. Nebyl jsem sám, kdo na toto téma vymýšlel zjednodušení. Zkoušelo se i např. položení sterilního krycího sklíčka na povrch tuhé půdy v Petriho misce, pod nímž se dělaly bubliny. Případně v kombinaci s disky, obsahujícími různé sacharidy.které se kladly na její povrch.
Při té příležitosti jsme si všiml, že některé kmeny mají různou pohyblivost podle toho, který konkrétní sacharid v půdě je. Tehdy to mělo význam jako určitá bližší identifikace kmene, zda jde, např. u kmene z pacientových močových cest, o něco, co má on sám ve střevě, nebo zda se jedná o nějaký nemocniční kmen. Dnes by se to řešilo o něco rychleji (ale dráž) pomocí DNA sond.
Po mnoha letech jsem si ověřil na jinak konstruovaných půdách, že to skutečně funguje jako tenkrát, když jsem si toho všiml.
Jedna naše studentka měla kolekci kmenů od pacientů a studentů, testovala na nich citlivost na antibiotika, a tak jsme k tomuto vyšetření přibrali i standardní testy biochemické aktivity a pohyblivosti, a při té příležitosti jsme otestovali i ten vliv různých sacharidů na pohyblivost.
Původní zadání práce ovšem bylo, jak jsou rozšířeny citlivé a méně citlivé kmeny. Představa byla taková, že pacienti z lůžkových oddělení budou mít v sobě kmeny spíše rezistentní, protože mají větší příležitost se infikovat právě nemocničními kmeny, které se po oddělení "toulají" (navíc jsou sami léčeni antibiotiky, při čemž mohou získat rezistenci i jejich vlastní bakterie ze střeva), zatímco ambulatní pacienti budou mít riziko přítomnosti těchto kmenů ve střevě menší. To se potvrdilo. Vedle toho měla autorka ještě představu, že u studentů, kteří nebyli antibiotiky léčeni, bude situace lepší než u těch ambulantně léčených pacientů. Ta se však nepotvrdila. Naopak jsme toto porovnání uzavřeli konstatováním, že studenti, jakmile začnou mít výuku na klinikách, se okamžitě infikují multirezistentními nemocničními kmeny a jsou na tom skoro stejně, jako lůžkoví pacienti.